本发明提供了一种新型内切葡聚糖酶,其氨基酸序列为SEQ ID NO:1,该内切葡聚糖酶是从粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)中分离得到的。本发明的内切葡聚糖酶最适作用温度为55°C,且在40°C-70°C范围内能保持80%以上的酶活力;最适pH值为6.0,且在pH4.0-7.0范围内能保持60%以上的酶活力。所述内切葡聚糖酶可广泛应用于纺织领域,对针织面料、梭织面料和牛仔面料的处理效果显著,还能缩短工时,降低生产成本。
1.一种内切葡聚糖酶,其特征在于,所述的内切葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQxa0IDxa0NO:1。
2.一种基因,其特征在于,所述基因编码权利要求1所述的内切葡聚糖酶。
3.如权利要求2所述的基因,其特征在于,所述的基因的核苷酸序列为SEQxa0IDxa0NO:2。
4.一种重组表达载体,其特征在于,所述的重组表达载体携带有权利要求2所述的基因。
5.一种重组表达宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞携带有权利要求4所述的重组表达载体。
6.如权利要求5所述的重组表达宿主细胞,其特征在于,所述的宿主细胞为黑曲霉(Aspergillusxa0niger)。技术领域
本发明属于功能基因筛选技术领域,具体涉及一种内切葡聚糖酶及其应用。
背景技术
纤维素是由β-1,4-糖苷键连接而成D-吡喃式葡萄糖聚合物,是地球上最丰富且可再生的资源。据估计,地球上每年光合作用产生1.5×10¹¹亿吨纤维素(Ryu,D.D等,1980,Enzymexa0andxa0Microbialxa0Technology)。多数情况下,要高值化利用纤维素首先必须通过纤维素酶对其进行有效降解。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称,它们协同作用,将纤维素降解为寡糖和纤维二糖,最终水解为葡萄糖。一般将纤维素酶分为三类:(1)内切葡聚糖酶:来自真菌简称EG,来自细菌简称Len,又称为C1酶。这类酶作用于纤维素内部的非结晶区,随机水解β-1,4糖苷键,将长链纤维素分子截短,产生大量含非还原性末端的小分子纤维素。(2)外切葡聚糖酶或纤维二糖酶:来自真菌简称CBH,来自细菌简称Cex,又称为Cx酶。这类酶作用于纤维素线状分子末端,水解1,4-β-D糖苷键,每次切下1个纤维二糖分子,故又称为纤维二糖水解酶。(3)β-葡萄糖苷酶:简称BG酶。这类酶将纤维二糖和寡糖水解成葡萄糖分子。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中,细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于工业生产的纤维素酶来自于真菌,比较典型的是木霉属、曲霉属和青霉属。而不同来源的纤维素酶具有不同的酶学性质,可在不同的工业领域发挥各自的功效。因此,筛选新型的纤维素酶就具有重要的应用的价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型内切葡聚糖酶及其应用,并采用基因工程技术手段将粉红粘帚霉菌(Gliocladiumxa0roseum)的内切葡聚糖酶基因转化入黑曲霉(Aspergillusxa0niger)中,构建得到了高效表达该酶的重组菌株,从而有利于实现该酶的工业化生产和广泛应用。本发明一方面提供了一种内切葡聚糖酶,其特征在于:1)其氨基酸序列为SEQxa0IDxa0NO:1的内切葡聚糖酶;2)在1)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的,具有1)中内切葡聚糖酶活性的酶。上述的内切葡聚糖酶是从粉红粘帚霉(Gliocladiumxa0roseum)中分离的。本发明另一方面提供了编码上述内切葡聚糖酶的基因,其一种核苷酸序列为SEQxa0IDxa0NO:2。本发明提供了一种表达载体,其包含上述编码内切葡聚糖酶的核苷酸序列。本发明还提供了一种表达宿主细胞,其携带有表达上述内切葡聚糖酶基因的表达载体。上述表达宿主细胞为黑曲霉(Aspergillusxa0niger)。本发明提供了一种新型内切葡聚糖酶,并通过构建黑曲霉工程菌株,实现了该酶的体外表达。所述内切葡聚糖酶的最适作用温度为55°C,且在40°C-70°C范围内能保持80%以上的酶活力;最适pH值为6.0,且在pH4.0-7.0范围内能保持60%以上的酶活力。所述内切葡聚糖酶可广泛应用于纺织领域,对针织面料、梭织面料和牛仔面料的处理效果显著,还能缩短工时,降低生产成本。
附图说明
图1:本发明构建的重组表达质粒pGm-1028图谱。图2:阳性转化子黑曲霉ZL-2发酵液上清SDS-PAGE电泳图,其中箭头所指24.8KD处的蛋白条带即为本发明所述内切葡聚糖酶。图3:内切葡聚糖酶相对酶活-温度变化曲线图。图4:内切葡聚糖酶相对酶活-pH变化曲线图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常可按常规条件,如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件运行。实施例1:内切葡聚糖酶基因的克隆以粉红粘帚霉(Gliocladiumxa0roseum)全基因组DNA为模板进行PCR扩增,其中PCR过程所用到的引物分别为:正向引物:5′-CCGCTCGAGAGGATGGCCCCTGCCCTTCAAGTTGTCT-3′;反向引物:5′-TGCTCTAGATCATGCTGAAGGGAATTGTCCATCATCAGAC-3′;其中下划线处分别表示Xhol1、Xbal1两个限制性内切酶的酶切位点。PCR扩增条件为:98°C30s;98°C10s;72°C30s30个循环;72°C10min,所用的DNA聚合酶为Phusionxa0DNA聚合酶;利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。用Xhol1和Xbal1两种限制性内切酶分别对PCR产物以及载体pGm进行酶切;运用胶纯化试剂盒对这两种酶切产物进行纯化,并用T₄DNA连接酶连接上述两个酶切产物;将连接后的产物转化大肠杆菌DH5α,用氨苄青霉素进行选择。为确保正确,对若干个转化子进行菌落PCR并进行测序。测序结果显示,上述PCR扩增产物的核苷酸序列为SEQxa0IDxa0NO:2;其编码的氨基酸序列为SEQxa0IDxa0NO:1;多个克隆的测序结果都一致。经NCBIxa0Blast比对发现,SEQxa0IDxa0NO:1与来源于Verticilliumxa0dahliaexa0VdLs.17的内切葡聚糖酶同源性最高,为62%,表明本发明扩增得到的是一个编码内切葡聚糖酶的新等位基因。使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中提取重组质粒,命名为pGm-1028(质粒图谱见图1)。实施例2重组质粒转化黑曲霉G1菌株及验证吸取黑曲霉(Aspergillusxa0niger)G1孢子悬浮液于CMA平板中心(9cm培养皿),待菌落长满整个培养皿,切1/4大小的培养基于200mLxa0CMA液体培养基中,在30°C、200rpm的条件培养14~16h。用无菌的Miracloth滤布收集菌体,并用solutionxa0A冲洗一次,在无菌条件下用棉签将其转移到40ml的裂解液中,在30°C、200rpm条件下裂解两个小时,用显微镜观察原生质体的形成情况。用无菌的Miracloth滤布过滤上述裂解液,用两个50ml无菌离心管收集原生质体并用solutionxa0B冲洗定容使每管大约25ml。在2000rpm条件下离心5min弃去上清,用20mlxa0solutionxa0B对沉淀再清洗沉淀两次。将沉淀重悬浮于10mLsolutionxa0B中,并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上清液,根据血球计数板计数结果,加入适量溶液B重悬沉淀,使得原生质体数目在1×10⁷个/mL左右。在冰上向预先冷却的15ml离心管中加入100μL上述原生质体、10μL重组质粒pGm-1028、12.5μLxa0solutionxa0C冰浴20min。与此同时将预先配制好的上层试管MMSA融化并置于55°C水浴中。取出冰浴中的15ml离心管,向其加入1mlxa0solutionxa0C、2mlxa0solutionxa0B并混匀后作为混合液。向3个融化的上层MMSA试管中的每一个中加入1ml上述混合液混匀并立即倒于MMSA平板中,将此平板在30°C培养箱中培养7-10d直到长出转化子。将长出的转化子菌株接入到二次筛选培养基中培养直至长出黑色菌落;提取菌落的基因组DNA,并按照实施例1所述PCR反应条件进行PCR扩增;通过胶回收与测序验证,验证结果正确的菌株即为阳性转化子,将其中一株阳性转化子命名为黑曲霉ZL-2(Aspergillusxa0nigerxa0ZL-2)。Solutionxa0A:2.5mL1Mxa0K₂HPO₄,2.5mL1Mxa0KH₂PO₄,48.156gxa0MgSO₄,加入dlH₂O至终体积500mL,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。Solutionxa0B:5mL1Mxa0Tris(pH7.5),2.77gxa0CaCl₂,109.32g山梨醇,加入dlH₂O至终体积500mL,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。Solutionxa0C:250gxa0PEG4000,2.77gxa0CaCl₂,5mL1Mxa0Tris(pH7.5),加入dlH₂O至终体积500mL,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。裂解液:将0.6g裂解酶(Lysingxa0Enzymexa0fromxa0Trichodermaxa0harzianum,Sigma)溶解于40mL溶液A中,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。MMSA平板:0.59g乙酰胺(Sigma),3.4gxa0CsCl(Sigma),0.52gxa0KCl,1.52gKH₂PO₄,218.5g山梨醇,1ml微量元素(见下),20g琼脂,加入dlH₂O至终体积972.5mL,高压蒸汽灭菌后加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgSO₄。MMSA上层琼脂试管:0.59g乙酰胺(Sigma),3.4gxa0CsCl(Sigma),0.52gxa0KCl,1.52gxa0KH₂PO₄,218.5g山梨醇,1ml微量元素(见下),10g低熔点琼脂糖,加入dlH₂O至终体积972.5mL,高压蒸汽灭菌后,在培养基未凝固时,加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgSO₄,之后立即分装于无菌试管中,每管10mL。微量元素:在250mLxa0dlH₂O中加入1gxa0FeSO₄.7H₂O,8.8gxa0ZnSO₄.₇H₂O,0.4gxa0CuSO₄.5H₂O,0.15gxa0MnSO₄.4H₂O,0.1gxa0Na₂B₄O₇.10H₂O,50mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O,0.2mL浓HCl,完全溶解后用dlH₂O定容至1L,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。CMA平板:20g葡萄糖,20g麦芽浸出物,1g蛋白胨,15g琼脂,加入dlH₂O至终体积1000mL,高压蒸气灭菌。CMA液体培养基:20g葡萄糖,20g麦芽浸出物,1g蛋白胨,加入dlH₂O至终体积1000mL,高压蒸气灭菌。二筛培养基:0.59g乙酰胺(Sigma),3.4gxa0CsCl(Sigma),0.52gxa0KCl,1.52gKH₂PO₄,1ml微量元素,20g琼脂,加入dlH₂O至终体积972.5mL,高压蒸汽灭菌后加入用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgSO₄。实施例3阳性转化子菌株的发酵验证挑取阳性转化子黑曲霉ZL-2,接种于20mlxa0TSB发酵培养基中,在30°C,200rpm的条件下培养5d;所得发酵液用8层纱布过滤,滤液在14000g条件下离心10min,收集上清液;将上清液在浓度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳分析。结果如图2所示,箭头所指24.8kDa处有一清晰的蛋白条带,与本发明所述内切葡聚糖酶的理论分子量大小一致。TSB发酵培养基:12gxa0NaNO₃,0.5gxa0KCl,1.5gxa0KH₂PO₄,2.05gxa0MgSO₄.7H₂O,3.5gxa0NaH₂PO₄.H₂O,45g胰蛋白大豆肉汤,70g柠檬酸钠,1g吐温80,1mL微量元素(见下),加入dlH₂O至终体积700mL,高压蒸气灭菌后加入300mL用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌的40%麦芽糖。微量元素:在250mLxa0dlH₂O中加入1gxa0FeSO₄.7H₂O,8.8gxa0ZnSO₄.₇H₂O,0.4gxa0CuSO₄.5H₂O,0.15gxa0MnSO₄.4H₂O,0.1gxa0Na₂B₄O₇.10H₂O,50mg(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O,0.2mL浓HCl,完全溶解后用dlH₂O定容至1L,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。实施例4内切葡聚糖酶酶活测定1、酶活测定的方法:CMC法2、测定的原理:纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和单糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂发生显色反应。反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力。3、测定过程:取三支试管各加入0.5mlCMC底物,与待测酶液一起50°C水浴预热5min。在第一、二试管中各加入0.5ml待测液,并计时,50°C水浴中反应15min。反应完后在三支试管中各加入1.5ml的DNS试剂,并在第三支试管中补加0.5ml的待测酶液。取出并摇匀三支试管后,在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温,用水定容至5.0ml。以第三支试管液为对照在540nm波长条件下测得第一、二试管液的吸光度。根据预先绘制的标准曲线计算出酶活力值。4、酶活力计算:酶活力(IU/ml或IU/g)=(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n式中:180—葡萄糖从微克换算成微摩尔15—待测液与底物的反应时间0.5—加入反应的待测酶液量n—酶样的稀释倍数采用上述方法测定实施例3获得的黑曲霉ZL-2发酵上清液,结果显示其酶活为218.17U/ml。实施例5酶学性质分析1、最适作用温度以NaH₂PO₄-Na₂HPO₄为缓冲溶液(pH6.0),分别在30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C条件下,测定上述黑曲霉ZL-2发酵上清液的酶活,以最高酶活计100%,计算相对酶活。结果如图3所示,本发明所述内切葡聚糖酶的最适作用温度为55°C,且在40°C-70°C范围内能保持80%以上的酶活力。2、最适作用pH分别以pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液稀释上述黑曲霉ZL-2发酵上清液,并在55°C条件下测定其酶活,以最高酶活计100%,计算相对酶活。结果如图4所示,本发明所述内切葡聚糖酶的最适pH值为6.0,且在pH4.0-7.0范围内能保持60%以上的酶活力。实施例6内切葡聚糖酶在纺织领域的应用1、针织面料、梭织面料的除毛染色一浴工艺应用温度为40-55°C;处理时间为50-150分钟;pH范围为5.0-8.0;适用的浴比范围为1:5-1:30,使用的设备类型为溢流染色机,卷染机,水洗机等,本发明所述内切葡聚糖酶的用量为600-800U/L。利用本发明的内切葡聚糖酶处理针织面料和梭织面料,不仅除毛干净,而且对织物的强力损失小。2、牛仔面料的起花及除毛应用工艺应用温度为45-55°C;处理时间为15-50分钟;pH范围为4.0-7.5;适用于单独石磨洗条件下的除毛、起花工艺;适用的浴比范围为1:5-1:25,使用的设备类型为工业水洗机等,内切葡聚糖酶的用量为450-800U/L。利用本发明的内切葡聚糖酶处理牛仔面料,除毛干净,起花均匀,花点较小,对织物强力损失小,效果明显。综上,本发明的内切葡聚糖酶可广泛应用于纺织领域,对针织面料、梭织面料和牛仔面料的处理效果显著,还能缩短工时,降低生产成本。 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